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臨床FFPE核酸提取試劑盒的操作中哪些更有利于正確結果
發布日期：
2019-03-18
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臨床FFPE核酸提取試劑盒為從經福爾馬林固定石蠟包埋組織（簡稱FFPE）中提取DNA提供一種高質量、快速、的方法。本試劑盒采用可以特異性結合DNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統。可大限度去除雜質蛋白及細胞中其他有機化合物。使用本試劑盒提取DNA無需用二甲苯去蠟，操作簡單、安全。提取所得的DNA可直接應用于PCR等下游實驗。
1.將石蠟樣品切成5-10μm厚的切片。注意：若石蠟塊保存于室溫，則棄去起始的2~3片切片。切片厚度以5μm為佳，適當去除無組織的蠟質可提高提取效率。
2.將4-8片切片置于1.5-mL離心管中（自備），加入300μL除蠟液DB。
3.將離心管置于80℃孵育30min，期間10min后取出短暫渦旋混勻。
4.于室溫冷卻2-3min，加入10μL的蛋白酶K，渦旋混勻，55℃孵育30-60min至無明顯組織塊。（視組織量的多少，可酌情減少或增加孵育時間。）
5.13,000rpm離心1min。用槍頭小心刺穿液面表層蠟膜，取下層清液至新的1.5-mL離心管中（自備）。
注意：切勿吸到上層渾濁蠟層，否則石蠟可能對DNA純度有影響。
6.加入400μL裂解液LB，顛倒混勻，室溫靜置10min。
7.加入800μL無水乙醇，渦旋10sec。
8.將吸附柱置于2-mL收集管中，再將上述液體轉移至吸附柱中，每次加入750μL，13,000rpm離心1min，棄收集管中的濾液。
9.重復步驟8，直至將所有溶液都經過吸附柱過濾，棄濾液。
10.向吸附柱中加入已用無水乙醇配制的洗滌液WB1500μL，13,000rpm離心1min，棄廢液。
11.將吸附柱重新放回2-mL收集管中，加入600μL洗滌液WB2，13,000rpm離心1min，棄廢液。
12.重復步驟11兩次。
13.將吸附柱重新放回2-mL收集管中，于室溫13,000rpm空柱離心1min后，置于新的1.5-mL無核酸酶污染的離心管中。開蓋室溫靜置或超凈工作臺風干5min，以*揮發殘余的乙醇。
注意：殘留的乙醇可能會影響后續的PCR等實驗。
14.向吸附柱柱膜中央上方小心加入35-100μL無核酸酶污染的純水（此步驟請謹慎操作，槍頭請勿接觸柱膜，純水經65℃溫浴后再加入有助于提高洗脫效率），室溫靜置3-5min，13,000rpm離心1min，洗脫液即為DNA溶液。（建議：為提高DNA濃度，可將洗脫液重新加回柱膜中央，靜置3min后，以13,000rpm離心1min洗脫DNA。）
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