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磷酸化蛋白多重檢測的方法分析
發布日期：
2018-06-26
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蛋白質磷酸化由蛋白質激酶所催化，磷酸化多發生在多肽鏈絲氨酸，蘇氨酸的羥基上，偶爾也發生在酪氨酸殘基上，這種磷酸化的過程受細胞內一種蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白質可以增加或降低它們的活性，例如：促進糖原分解的磷酸化酶，無活性的磷酸化酶b經磷酸化以后，變成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I經磷酸化以后變成無活性的糖原合成酶D，共同調節糖原的合成與分解。以下簡要介紹幾種常用的磷酸化蛋白多重檢測的方法。
1.westernblot
檢測蛋白磷酸化狀態的常用方法是westernblot，過程是先用SDS-PAGE分離生物樣品，接著轉移到膜上，后利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。典型的Westernblot實驗步驟避免了使用放射性同位素時的危險品和廢物處理要求。磷酸化特異抗體大多十分靈敏，可輕松檢測常規樣品中的磷酸化蛋白。
2.酶聯免疫吸附分析(ELISA)
ELISA的定量能力比Westernblot更強，非常有助于研究激酶活性調節及其功能。這種微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特異的捕獲抗體，和磷酸化狀態無關。隨后讓目的蛋白結合在抗體包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設計為顯色或熒光檢測。產生的信號強度與初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。
3.激酶活性分析
蛋白激酶通常是多個信號轉導網絡的常見組分，它們影響了眾多負責生物反應的下游效應物，因此，評估某個特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報告系統來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。
4.磷酸化特異抗體的開發
20世紀90年代，科學家利用合成的磷酸化肽段來免疫兔子，開發出多個磷酸化狀態特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標蛋白磷酸化位點周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現為傳統方法的改進以及新的免疫分析技術的開發打開了大門。在任何技術中使用磷酸化特異抗體都要注意，成功的檢測依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。
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